本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基，其配方为：MS基本培养基、蔗糖30g/L、琼脂0.7wt%、6?BA?3mg/L、2,4?D?0.5mg/L和ABA?1.0?mg/L。通过在培养基中添加精选的激素，并确定相应浓度，使得该培养基可有效促进苋菜愈伤组织的生长，同时大大提高了愈伤组织中类黄酮的含量，从而为实现苋菜类黄酮的量产奠定基础。
申请号： CN201810608573.0 专利名称： 一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基 申请（专利权）人： [福建农林大学] 发明人： [刘生财, 潘君飞, 彭丽云, 赵春丽, 王晓, 赖钟雄, 张梓浩] 其他信息：一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基
技术领域
本发明属于作物栽培技术领域，具体涉及一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基。
背景技术
苋菜(Amaranthus tricolor L.)是石竹目苋科的一年生草本植物，别名雁来红、三色苋，有些地方称为“长寿菜”。苋菜营养丰富，在氨基酸、脂肪酸及微量元素等的组成和含量方面是一种难得的优质功能食品资源。有研究表明食用苋菜对促进人的牙齿和骨骼的生长，促进造血和凝血，提高抗氧化、抗菌、抗癌、降糖及降血压、护肝等方面具有较好的效果。
苋菜中含有大量的甜菜红素、类黄酮等抗氧化性物质，具有极高的药用和食用价值。在苋菜中有大量的甜菜色素和酚类物质被检测出来。近年来，以植物提取次生代谢物质领域发展迅速，已成为生物工程技术的热点，并与基因工程和快繁技术一起，成为当前植物生物科技的三大主流。植物次生代谢产物细胞工程利用植物细胞体系培养细胞，采用先进的生物技术，提供了各种次生代谢产物医药、食品、色素、化工产品。植物次生代谢产物细胞工程的理论基础是植物细胞的全能性。在适宜的培养条件下，所有活的植物细胞都具有形态发育上的全能性和内在的生理代谢过程的全能性。利用苋菜栽培资源提取保健成分易受耕地资源、生长周期、存储和运输等自然条件的限制。因此，如何通过苋菜愈伤组织培养实现类黄酮等次生代谢产物的量产，具有广泛的应用意义。
激素种类和浓度对植物细胞的生长和次生代谢产物的积累有着显著的影响。其中，脱落酸(abscisic acid , ABA)对植物的生长发育具有重要的调控作用。过去对脱落酸的研究主要集中在植物衰老、细胞死亡和组织器官的脱落等方面, 被认为是一种生长抑制物质。随着研究的深入, 人们发现ABA 在植物生长发育过程中还具有促进作用, 包括体细胞胚的发生和发育、种子发育与休眠、细胞分裂、组织器官的分化与形成等，对其调控的机制有了较深入的了解。本发明中发现，ABA可以促进苋菜愈伤组织的增殖，可能是苋菜愈伤组织在培养后期处于缺水的干旱胁迫状态，而ABA能明显减少细胞水分蒸发, 降低细胞膜透性, 增加可溶性蛋白质含量, 诱导生物膜系统保护酶形成, 降低膜脂过氧化程度保护膜结构的完整性, 增强植物细胞逆境胁迫下的抗氧化能力, 进而提高愈伤组织的抗旱性，使得愈伤组织在培养后期还能正常增殖。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基。本发明的培养基可有效促进苋菜愈伤组织的生长，同时大大提高了愈伤组织中类黄酮的含量，从而为实现苋菜类黄酮的量产奠定基础
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基，其配方为：MS基本培养基、蔗糖30g/L、琼脂0.7wt%、6-BA 3mg/L、2,4-D 0.5mg/L和ABA（脱落酸）1.0 mg/L。
所述培养基的pH值为5.8。
本发明的有益效果在于：
本发明从众多的生长激素中筛选得到有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的激素，并且通过确定培养基的具体成分及用量，尤其是激素在培养基中的浓度，显著提高了苋菜愈伤组织的生长及类黄酮积累，有利于量产。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
一、材料与方法
1、材料
由福建农林大学园艺植物生物工程研究所诱导并继代保存的苋菜愈伤组织。
2、方法
以MS为基本培养基，添加浓度为30g/L的蔗糖，质量百分比为0.7%的琼脂，浓度为3mg/L的6-BA，0.5mg/L的2,4-D；培养基的pH值为5.8。以上述培养基为对照，在此基础上添加SA，PP333，GA3和ABA四种激素，浓度梯度设置为0.5、1.0、2.0mg/L，共13种培养基配方：
1：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L；
2：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 0.5 mg/L；
3：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 1.0 mg/L；
4：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 2.0 mg/L；
5：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 0.5mg/L；
6：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 1.0mg/L；
7：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 2.0mg/L；
8：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 0.5mg/L；
9：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 1.0mg/L；
10：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 2.0mg/L；
11：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 0.5mg/L；
12：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 1.0mg/L；
13：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 2.0mg/L；
将上述13种培养基经高温灭菌消毒20min后用以培养苋菜愈伤组织，其中每种培养基配制20瓶，分别接种四小块共0.6g的色泽鲜艳疏松的苋菜新鲜愈伤组织，培养条件为：25℃，以白色日光灯作为光源，光照强度为2000lx，光照周期为16h/d，培养时间为30d。
愈伤组织生长量测定：30d后分别将13种培养基中的苋菜愈伤组织取出，用电子天平称量每瓶愈伤组织的重量，为愈伤组织的鲜重，将愈伤组织置于60℃烘干到恒重后进行称重（万分之一电子天平），为每瓶愈伤组织的干重。整理数据，每种培养基测定的20个数据取平均值，作为该培养基的数据。
愈伤组织中类黄酮相对含量及产量的测定：（1）标准曲线的建立：精密称取芦丁2.5mg，用甲醇溶解后定容至25ml，即得到100mg/L芦丁标准溶液，取芦丁标准溶液0.1、0.5、1、3、5ml分别置于10ml刻度磨口试管中，各加入体积分数为50%乙醇溶液至5mL刻度，精确加入5wt% NaNO2溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入10wt% Al(NO3)3 溶液0.3mL，摇匀再放置6min，加入20% NaOH 溶液4mL，分别用体积分数为50%稀释至10ml，摇匀后放置 15min，于510nm波长检测吸光度，建立标准曲线。（2）样品制备：将上述13种培养基培养的苋菜愈伤组织后面烘干后，每种取0.3g，三次重复，加入体积分数为60%乙醇溶液10ml，超声提取1h（60℃，功率300w），冷却静置20min，（8000g，20℃）离心10min，将提取液定容至10ml。取材料的提取液5ml，各加入体积分数为50%乙醇溶液至 5mL 刻度，精确加入5wt% NaNO2溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入10wt% Al(NO3)3 溶液0.3mL，摇匀再放置 6min，加入 20wt%NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，于510nm波长检测吸光度，根据标准曲线计算类黄酮含量（mg/g）。类黄酮产量=每瓶愈伤组织类黄酮含量（干重）*每瓶愈伤组织的干重（g）。整理数据，每种培养基测定的3个数据取平均值，作为该培养基的数据。
二、结果分析
标准曲线：A=0.0175+9.56C，A为吸光度，C为芦丁浓度（mg/ml）
对13种培养基培养的苋菜愈伤组织各项测定结果进行统计，见下表：
由上表可知，最有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基配方为培养基12： MS基本培养基、30g/L的蔗糖、质量百分比为0.7%的琼脂、3mg/L的6-BA、0.5mg/L的2,4-D和1.0mg/L的ABA，培养基的pH值为5.8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
一、材料与方法
1、材料
由福建农林大学园艺植物生物工程研究所诱导并继代保存的苋菜愈伤组织。
2、方法
以MS为基本培养基，添加浓度为30g/L的蔗糖，质量百分比为0.7%的琼脂，浓度为3mg/L的6-BA，0.5mg/L的2,4-D；培养基的pH值为5.8。以上述培养基为对照，在此基础上添加SA，PP333，GA3和ABA四种激素，浓度梯度设置为0.5、1.0、2.0mg/L，共13种培养基配方：
1：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L；
2：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 0.5 mg/L；
3：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 1.0 mg/L；
4：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+SA 2.0 mg/L；
5：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 0.5mg/L；
6：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 1.0mg/L；
7：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+PP333 2.0mg/L；
8：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 0.5mg/L；
9：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 1.0mg/L；
10：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+GA3 2.0mg/L；
11：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 0.5mg/L；
12：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 1.0mg/L；
13：MS+30g/L的蔗糖+0.7wt%的琼脂+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ABA 2.0mg/L；
将上述13种培养基经高温灭菌消毒20min后用以培养苋菜愈伤组织，其中每种培养基配制20瓶，分别接种四小块共0.6g的色泽鲜艳疏松的苋菜新鲜愈伤组织，培养条件为：25℃，以白色日光灯作为光源，光照强度为2000lx，光照周期为16h/d，培养时间为30d。
愈伤组织生长量测定：30d后分别将13种培养基中的苋菜愈伤组织取出，用电子天平称量每瓶愈伤组织的重量，为愈伤组织的鲜重，将愈伤组织置于60℃烘干到恒重后进行称重（万分之一电子天平），为每瓶愈伤组织的干重。整理数据，每种培养基测定的20个数据取平均值，作为该培养基的数据。
愈伤组织中类黄酮相对含量及产量的测定：（1）标准曲线的建立：精密称取芦丁2.5mg，用甲醇溶解后定容至25ml，即得到100mg/L芦丁标准溶液，取芦丁标准溶液0.1、0.5、1、3、5ml分别置于10ml刻度磨口试管中，各加入体积分数为50%乙醇溶液至5mL刻度，精确加入5wt% NaNO2溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入10wt% Al(NO3)3 溶液0.3mL，摇匀再放置6min，加入20% NaOH 溶液4mL，分别用体积分数为50%稀释至10ml，摇匀后放置 15min，于510nm波长检测吸光度，建立标准曲线。（2）样品制备：将上述13种培养基培养的苋菜愈伤组织后面烘干后，每种取0.3g，三次重复，加入体积分数为60%乙醇溶液10ml，超声提取1h（60℃，功率300w），冷却静置20min，（8000g，20℃）离心10min，将提取液定容至10ml。取材料的提取液5ml，各加入体积分数为50%乙醇溶液至 5mL 刻度，精确加入5wt% NaNO2溶液0.3mL，摇匀后放置6min，加入10wt% Al(NO3)3 溶液0.3mL，摇匀再放置 6min，加入 20wt%NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，于510nm波长检测吸光度，根据标准曲线计算类黄酮含量（mg/g）。类黄酮产量=每瓶愈伤组织类黄酮含量（干重）*每瓶愈伤组织的干重（g）。整理数据，每种培养基测定的3个数据取平均值，作为该培养基的数据。
二、结果分析
标准曲线：A=0.0175+9.56C，A为吸光度，C为芦丁浓度（mg/ml）
对13种培养基培养的苋菜愈伤组织各项测定结果进行统计，见下表：
由上表可知，最有利于苋菜愈伤组织生长及类黄酮积累的培养基配方为培养基12： MS基本培养基、30g/L的蔗糖、质量百分比为0.7%的琼脂、3mg/L的6-BA、0.5mg/L的2,4-D和1.0mg/L的ABA，培养基的pH值为5.8。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。